总结几点关于PCR仪的应用经验，附保养注意事项

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                    <section data-role="outer" label="Powered by gulangu"><section><p><p><img src="image/20200927/c3b9c399831f50ead73d74f32d73592d_1.png" /></p></p><p><p><img src="image/20200927/01a3a819a4ee58f43ff8414001dc0c04_2.png" /></p></p><p><br  /></p></section><p><span>简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。</span></p><p><br  /></p><p><span>目前，常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="90940"><section data-width="100%"><section><section><section><p><img src="image/20200927/7353acf6044094d361edadfdd3431714_3.png" /></p></section></section><section data-brushtype="text"><strong>PCR产物的电泳检测时间</strong></section><section><section><p><img src="image/20200927/4f15c04c40158e65e132df7aaea9718b_4.png" /></p></section></section></section></section></section><p><br  /></p><p><span>一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="90940"><section data-width="100%"><section><section><section><p><img src="image/20200927/7353acf6044094d361edadfdd3431714_3.png" /></p></section></section><section data-brushtype="text"><strong>PCR反应的关键环节</strong></section><section><section><p><img src="image/20200927/4f15c04c40158e65e132df7aaea9718b_4.png" /></p></section></section></section></section></section><p><br  /></p><p><span>①板核酸的制备</span></p><p><br  /></p><p><span>②引物的质量与特异性</span></p><p><br  /></p><p><span>③酶的质量</span></p><p><br  /></p><p><span>④PCR循环条件，寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="90150"><section><section data-width="100%"><p data-brushtype="text">酶切分析</p></section></section></section><p><br  /></p><p><span>根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="90150"><section><section data-width="100%"><p data-brushtype="text">分子杂交</p></section></section></section><p><br  /></p><p><span>分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="90150"><section><section data-width="100%"><p data-brushtype="text">Southern印迹杂交</p></section></section></section><p><br  /></p><p><span>在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="90150"><section><section data-width="100%"><p data-brushtype="text">斑点杂交</p></section></section></section><p><br  /></p><p><span>将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。</span></p><p><br  /></p><p><span>氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。</span></p><p><br  /></p><p><span>一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。</span></p><p><br  /></p><p><span>RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止R-Nase降解RNA。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="90150"><section><section data-width="100%"><p data-brushtype="text">温度与时间的设置</p></section></section></section><p><br  /></p><p><span>基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。</span></p><p><br  /></p><p><span>在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。</span></p><p><br  /></p><p><span>对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="88354"><section><section><p><img src="image/20200927/117f4d64ca1e88af6b028359674aef71_7.gif" /></p></section></section></section><p><br  /></p><p><strong><span>实验操作注意事项：</span></strong></p><p><br  /></p><p><span>尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip792471">1</section></section></section></section></section></section><p><span>戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="">2</section></section></section></section></section></section><p><span>使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip452635">3</section></section></section></section></section></section><p><span>避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip90594">4</section></section></section></section></section></section><p><span>操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="">5</section></section></section></section></section></section><p><span>最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="">6</section></section></section></section></section></section><p><span>操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="">7</section></section></section></section></section></section><p><span>尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。</span></p><p><br  /></p><p><span>如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip958502">8</section></section></section></section></section></section><p><span>重复实验，验证结果，慎下结论。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="88354"><section><section><p><img src="image/20200927/117f4d64ca1e88af6b028359674aef71_7.gif" /></p></section></section></section><p><br  /></p><p><strong><span>在仪器的维护保养中，需要注意以下问题：</span></strong></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip119801">1</section></section></section></section></section></section><p><span>PCR仪器需要定期检测，视制冷方式而定一般半年至少一次。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip510832">2</section></section></section></section></section></section><p><span>PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的，当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1～2℃时，可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip754343">3</section></section></section></section></section></section><p><span>PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制，要求越短越好，当PCR仪的降温过程超过60s，就应该检查仪器的制冷系统，对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘；对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。</span></p><p><br  /></p><section data-tools="gulangu" data-id="91563"><section data-role="paragraph"><section><section data-width="100%"><section><section data-brushtype="text" data-original-title="" title="" aria-describedby="tooltip939419">4</section></section></section></section></section></section><p><span>一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时，不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件，必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。</span></p><section><p><br  /></p><p><span><strong><span>【版权声明】：</span><span>本文由整理发布，资料源自修社，版权归原作者所有，转载请注明来源！</span></strong><br  /><br  /></span></p><section><p><img src="image/20200927/200097153c0fd6c4a2af471bc6042bc0_9.jpg" /></p><span><strong>微信ID：yxiubang</strong></span></section><section><span><strong><p><img src="image/20200927/0a8607a88b19f6a44d0b44de3db914af_10.jpg" 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