MTT实验步骤详细流程

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                    <p style="line-height: 1.75em;">MTT常用浓度为5mg/ml。</p><p style="line-height: 1.75em;">1、药物的细胞毒性</p><p style="line-height: 1.75em;">四唑盐（MTT）比色法操作步骤</p><p style="line-height: 1.75em;"><span style="color: rgb(255, 0, 0);"><strong><span style="font-size: 18px;">接种细胞</span></strong></span></p><p style="line-height: 1.75em;">（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。</p><p style="line-height: 1.75em;">（2）离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。</p><p style="line-height: 1.75em;">（3）将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml，每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。</p><p style="line-height: 1.75em;">（4）用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。</p><p style="line-height: 1.75em;">（5）将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。</p><p style="line-height: 1.75em;">（6）将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。</p><p style="line-height: 1.75em;"><span style="color: rgb(255, 0, 0);"><strong><span style="font-size: 18px;">添加药物</span></strong></span></p><p style="line-height: 1.75em;">（7）用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。</p><p style="line-height: 1.75em;">（8）对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。</p><p style="line-height: 1.75em;">（9）在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。</p><p style="line-height: 1.75em;">（10）在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。</p><p style="line-height: 1.75em;">（11）向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。</p><p style="line-height: 1.75em;">（12）将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。</p><p style="line-height: 1.75em;">生长期</p><p style="line-height: 1.75em;">（13）在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。</p><p style="line-height: 1.75em;">（14）每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。</p><p style="line-height: 1.75em;"><span style="font-size: 18px;"><strong><span style="color: rgb(255, 0, 0);">存活细胞数的估算</span></strong></span></p><p style="line-height: 1.75em;">（15）在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。</p><p style="line-height: 1.75em;">（16）用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。</p><p style="line-height: 1.75em;">（17）弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。</p><p style="line-height: 1.75em;">（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。</p><p style="line-height: 1.75em;">（19）立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。</p><p style="line-height: 1.75em;"><strong><span style="font-size: 18px; color: rgb(255, 0, 0);">结果分析</span></strong></p><p style="line-height: 1.75em;">以药物浓度为横坐标（X轴），吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。</p><p style="line-height: 1.75em;">2、四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝</p><p style="line-height: 1.75em;">四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。</p><p style="line-height: 1.75em;">无菌材料：生长液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA，1mmol/L，溶于PBSA中）；MTT： 3- (4，5) -双甲基 - 2 -噻唑 - (2 ，5) -二甲苯基溴化四氮唑，50mg/ml，滤过除菌; Sorensen 甘氨酸缓冲液（0.1mol/L甘氨酸， 0.1mol/L NaCl，用1mol/L NaOH将PH调至10.5 ）;微滴定板（Linbro，ICN）; 微吸头，最好放在高压灭菌的吸头盒中。</p><p style="line-height: 1.75em;">非灭菌材料的准备：塑料盒（无毒的聚苯乙烯，装培养板用）；加样。</p><hr style="white-space: normal;"  /><p style="white-space: normal; text-align: center; line-height: 1.75em;"><strong style="font-size: 14px; line-height: 21px; color: rgb(255, 255, 255); font-family: arial, helvetica, sans-serif; margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important;"><span class="bkcolor" style="margin: 0px 8px 0px 0px; padding: 4px 10px; max-width: 100%; border-top-left-radius: 5px; border-top-right-radius: 5px; border-bottom-left-radius: 5px; border-bottom-right-radius: 5px; background-color: rgb(191, 0, 0); box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important;"></span></strong><br  /></p><p style="white-space: normal; text-align: center; line-height: 1.75em;"><strong><span style="line-height: 2em; color: rgb(255, 0, 0);">ID: </span></strong></p><p style="white-space: normal; text-align: center; line-height: 1.75em;"><span style="font-size: 14px;">最具人气的医疗器械维修新媒体平台</span></p><p style="white-space: normal; text-align: center; line-height: 1.75em;"><span style="font-size: 11px;"><span style="font-size: 14px;">分享医疗器械前沿动态、医疗器械维修经验</span>        </span></p><p style="white-space: normal; text-align: center; line-height: 1.75em;"><span style="font-size: 14px;">医疗器械维修人自己的交流平台</span></p><p style="white-space: normal; text-align: center; line-height: 1.75em;"><strong><span style="color: rgb(127, 127, 127); font-size: 11px;">加群主微信 </span></strong><strong><span style="color: rgb(149, 55, 52); font-size: 11px;">shanying916</span></strong><strong><span style="color: rgb(127, 127, 127);"><span style="font-size: 11px;"><span style="color: rgb(149, 55, 52); font-size: 11px;"></span> </span><span style="font-size: 12px;">与更多行业从业人员互动交流</span></span></strong><strong style="line-height: 1.75em; font-size: 16px;"><span style="color: rgb(127, 127, 127); font-size: 12px;">            </span></strong></p><p style="white-space: normal; line-height: 1.75em; text-align: center;"><strong><span style="color: rgb(127, 127, 127);"><span style="font-size: 12px;"><img data-s="300,640" data-type="jpeg" src="http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz/A1DicCH9Vl6MoypciaNOibiaxmVLk8eA6ibKL14uWjKsZwrWboQYKTfXqPicXycwL1icfia1pAG0VzlTX3MRR4FPV0ZtZA/0" data-ratio="1.0136054421768708" data-w="147"  /></span></span></strong></p>